Détection du virus responsable de la COVID-19 à l’aide de la RT-PCR en temps réel

La RT-PCR en temps réel est une technique dérivée du nucléaire qui permet de détecter la présence de matériel génétique propre à un agent pathogène, notamment un virus. Initialement, le matériel génétique était détecté au moyen de marqueurs isotopiques, mais la méthode a ensuite été perfectionnée et d’autres types de marqueurs, le plus souvent des colorants fluorescents, remplacent aujourd’hui les isotopes radioactifs. Avec cette technique, les scientifiques peuvent visualiser les résultats de façon presque immédiate, avant que le processus soit terminé, tandis que la RT-PCR classique ne donne un résultat qu’à la fin.

Bien que la RT-PCR en temps réel soit la méthode la plus couramment employée pour détecter les coronavirus, de nombreux pays ont encore besoin d’aide pour la mettre en œuvre et l’utiliser.

Un virus est un organisme microscopique constitué de matériel génétique entouré d’une enveloppe moléculaire. Ce matériel génétique peut être composé d’ADN ou d’ARN. 

L’ADN est une molécule à deux brins présente dans tout type d’organismes, notamment les animaux, les plantes et certains virus, qui contient le code génétique, c’est-à-dire le programme selon lequel l’organisme se construit et se développe.

L’ARN est une molécule, généralement composée d’un seul brin, qui copie et transcrit une partie du code génétique de l’organisme pour la transmettre à des protéines qui synthétisent d’autres molécules nécessaires à l’accomplissement des fonctions essentielles à la vie et au développement de l’organisme. Il existe différents types d’ARN permettant la copie, la transcription et la transmission du matériel génétique.

Certains virus, dont le coronavirus (SARS-Cov-2), ne contiennent que de l’ARN, ce qui signifie qu’ils ont besoin de s’infiltrer dans des cellules saines pour se multiplier et survivre. Une fois dans la cellule, le virus utilise son propre code génétique (de l’ARN dans le cas du coronavirus) pour prendre le contrôle de celle-ci et la « reprogrammer » pour qu’elle se mette à produire des virus.  

Pour détecter précocement ce type de virus dans l’organisme à l’aide de la RT-PCR en temps réel, les scientifiques doivent convertir son ARN en ADN selon un processus appelé « transcription inverse ». Cela est nécessaire car, contrairement à l’ADN, il n’est pas possible de copier, ou d’« amplifier », l’ARN en laboratoire. Or, l’amplification est une étape clé du processus de RT-PCR en temps réel pour la détection des virus.

Les scientifiques amplifient plusieurs centaines de milliers de fois une partie de l’ADN viral transcrit. L’amplification est une étape importante car elle permet aux scientifiques d’obtenir une grande quantité des segments de l’ADN viral pour pouvoir confirmer avec exactitude la présence du virus, et leur évite d’avoir à rechercher une quantité infime du virus parmi des millions de brins d’information génétique.

On prélève un échantillon sur des parties du corps où le coronavirus s’accumule, comme le nez ou la gorge. On traite l’échantillon avec plusieurs solutions chimiques pour le débarrasser de certaines substances, notamment les protéines et les graisses, et extraire uniquement l’ARN qu’il contient. L’ARN ainsi extrait contient à la fois le matériel génétique de la personne et, s’il est présent, l’ARN du virus.

L’ARN est alors converti en ADN, lors de la transcription inverse, grâce à une enzyme spécifique. Les scientifiques ajoutent ensuite de courts fragments d’ADN complémentaires de certains segments de l’ADN viral transcrit. Si le virus est présent dans l’échantillon, ces fragments s’attachent aux segments de l’ADN viral cible. Certains des fragments d’ADN ajoutés servent uniquement à construire de nouveaux brins d’ADN lors de l’amplification, tandis que les autres servent aussi au marquage des brins qui permettront de détecter le virus.

Le mélange est ensuite placé dans un appareil de RT-PCR, où il est chauffé et refroidi suivant des cycles qui déclenchent des réactions chimiques permettant d’obtenir de nouvelles copies, identiques, des segments de l’ADN viral cible. Les cycles se répètent de nombreuses fois pour continuer à copier les segments de l’ADN cible. À chaque cycle, la quantité double : on passe de deux copies à quatre, puis de quatre à huit et ainsi de suite. Le processus de RT-PCR comprend généralement 35 cycles, ce qui signifie qu’à la fin du processus, environ 35 milliards de nouvelles copies des segments d’ADN viral sont produites à partir de chaque brin de l’ARN viral présent dans l’échantillon.

À mesure que les copies des segments de l’ADN viral sont produites, les marqueurs se fixent sur les brins d’ADN et émettent une fluorescence qui est mesurée par l’ordinateur de l’appareil. Les résultats s’affichent en temps réels à l’écran. L’ordinateur effectue un suivi de la quantité de fluorescence dans l’échantillon à la fin de chaque cycle. Lorsque cette quantité dépasse un certain seuil, la présence du virus est confirmée. Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre ce seuil permet également aux scientifiques d’estimer la gravité de l’infection : plus le seuil est atteint rapidement, plus l’infection est grave.

La technique de RT-PCR en temps réel, hautement sensible et spécialisée, permet d’établir un diagnostic fiable en seulement trois heures, bien que les laboratoires mettent généralement six à huit heures en moyenne. Elle est beaucoup plus rapide que les autres méthodes d’isolation du virus disponibles et présente un risque plus faible de contamination ou d’erreur puisque toutes les étapes peuvent être réalisée dans un tube fermé. Parmi les méthodes disponibles, elle reste la plus précise pour la détection du coronavirus.

Les virus n’étant présents dans l’organisme que pendant une certaine durée, la RT-PCR en temps réel ne permet pas de déterminer si un individu a été infecté par le passé, ce qui est pourtant utile pour comprendre le développement et la propagation du virus. Pour détecter, suivre et étudier les infections passées, en particulier les infections asymptomatiques qui auraient contribué à la propagation du virus, d’autres méthodes sont nécessaires.

Depuis plus de 20 ans, l’AIEA, en partenariat avec la FAO, forme des experts du monde entier à l’utilisation de la technique de RT-PCR en temps réel et leur fournit du matériel, notamment dans le cadre de son réseau VETLAB, composé de laboratoires de diagnostic vétérinaire. Cette technique a récemment été utilisée pour diagnostiquer d’autres maladies, comme les maladies à virus Ebola et à virus Zika, le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (virus MERS-CoV), le syndrome respiratoire aigu sévère (virus SARS-Cov-1) et d’autres zoonoses et maladies animales importantes. Les zoonoses sont des maladies animales qui peuvent aussi toucher l’homme.