You are here

如何使用实时逆转录-聚合酶链反应检测2019冠状病毒病病毒?

,

实时逆转录-聚合酶链反应是最广泛使用的和最准确的新型冠状病毒实验室检测方法之一。(照片来源:原子能机构)

随着引起2019冠状病毒病的病毒在全世界蔓延,国际原子能机构(原子能机构)正在与联合国粮食及农业组织(粮农组织)结成伙伴,提供本机构的支助和专门知识,帮助各国使用检测、跟踪和研究冠状病毒的最准确的实验室方法之一 — 实时逆转录-聚合酶链反应。

但何谓实时逆转录-聚合酶链反应呢?它是如何工作的?  而且它和核技术有何关系?对于该技术、它是如何工作的以及一些关于病毒和遗传学的更新细节,本文在此做一个简单的概述。

何谓实时逆转录-聚合酶链反应?

实时逆转录-聚合酶链反应是一种核衍生方法,用于对来自任何病原体(包括病毒)的特定遗传物质的存在情况进行检测。最初,该方法使用放射性同位素标记物来检测目标遗传物质,但后来的改进导致同位素标记被特殊标记物取代,其中最常见的是荧光染料。有了这项技术,尽管过程仍在进行中,但科学家几乎可以立即看到结果;而常规的实时逆转录-聚合酶链反应只在最后提供结果。

虽然实时逆转录-聚合酶链反应是目前使用最广泛的冠状病毒检测方法,但许多国家在建立和使用该技术方面仍需要得到支助。

何谓病毒?何谓遗传物质?

病毒是由分子包膜包围的遗传物质微包。遗传物质既可以是脱氧核糖核酸,也可以是核糖核酸。 

脱氧核糖核酸是一种存在于所有生物体(如动物、植物和病毒)中的双链分子,它掌握着这些生物体如何形成和发展的遗传密码或蓝图。

核糖核酸通常是一种单链分子,它复制、转录并传递部分遗传密码给蛋白质,使蛋白质能够合成并执行维持生物体存活和发展的功能。核糖核酸有不同的变体进行这种复制、转录和传递。

有些病毒如冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)只含有核糖核酸,这意味着它们依赖于渗入健康细胞来繁殖和存活。一旦进入细胞,这种病毒就会利用自己的遗传密码(就冠状病毒而言为核糖核酸)控制并“重新编程”细胞,使其成为制造病毒的工厂。  

为了让冠状病毒这样的病毒在体内早期被利用实时逆转录-聚合酶链反应检测到,科学家们需要将核糖核酸转化为脱氧核糖核酸。这是一个被称为“逆转录”的过程。他们这样做是因为只有脱氧核糖核酸可以被复制或扩增,这是实时逆转录-聚合酶链反应检测病毒过程的一个关键部分。

科学家将转录后的病毒脱氧核糖核酸的特定部分扩增数十万倍。扩增是很重要的,这样科学家们就不必试图在数百万条遗传信息链中找出微小数量的病毒,而是有足够数量的病毒脱氧核糖核酸靶区来精确地确认病毒的存在。

实时逆转录-聚合酶链反应如何作用于冠状病毒?

从冠状病毒聚集的身体部位比如人的鼻子或喉咙采集一个样本。用几种化学溶液对样本进行处理,以去除蛋白质和脂肪等物质,只提取样本中存在的核糖核酸。这种提取的核糖核酸是一个人自己的遗传物质和冠状病毒的核糖核酸(如有)的混合物。

这种核糖核酸被利用一种特定的酶逆转录成脱氧核糖核酸。然后,科学家添加额外的脱氧核糖核酸短片段,这些片段与转录的病毒脱氧核糖核酸的特定部分互补。如果病毒存在于样本中,这些片段就会附着到病毒脱氧核糖核酸的靶区。添加的遗传片段有一部分是为了在扩增时构建脱氧核糖核酸链,其他的则是为了构建脱氧核糖核酸并在链上添加标记物标签,然后用来检测病毒。

随后,这种混合物被置于逆转录-聚合酶链反应机中。机器在加热和冷却混合物的温度中循环,从而引发特定的化学反应,产生新的、相同的病毒脱氧核糖核酸靶区拷贝。这个循环一遍又一遍地重复,继续复制病毒脱氧核糖核酸的靶区。每循环一次都使先前的数量倍增:两份拷贝变成四份,四份变成八份,以此类推。一个标准的实时逆转录-聚合酶链反应装置通常要经过35次循环,这意味着在这个过程结束时,从样本中存在的每一条病毒链中产生大约350亿个新的病毒脱氧核糖核酸靶区拷贝。

当病毒脱氧核糖核酸靶区的新拷贝被构建时,标记物标签附着在脱氧核糖核酸链上,然后释放出一种荧光染料,这种染料由机器的计算机测量并实时显示在屏幕上。计算机跟踪样本中每次循环后的荧光量。当荧光量超过某一荧光水平时,这就证实病毒存在。科学家们还监测需要多少次循环才能达到这个水平,以便估计感染的严重程度:循环越少,病毒感染越严重。

为什么要用实时逆转录-聚合酶链反应方法?

实时逆转录-聚合酶链反应技术具有高度的敏感性和特异性,可以在三小时内提供可靠的诊断,而通常实验室平均需要六到八小时。与其他可用的病毒分离方法相比,实时逆转录-聚合酶链反应的速度明显较快,并且由于整个过程可以在封闭的试管内完成,具有较低的产生污染或错误的可能性。它仍然是可用的检测冠状病毒的最准确方法。

实时逆转录-聚合酶链反应不能用于检测过去的感染(尽管这对了解病毒的发展和传播很重要),因为病毒仅在特定的时间窗口内存在于体内。需要采用其他方法检测、跟踪和研究过去的感染,特别是那些可能已经发展和传播而没有症状的感染。

20多年来,原子能机构与粮农组织结成伙伴,特别是通过其兽医诊断实验室网,为来自世界各地的专家使用实时逆转录-聚合酶链反应方法提供了培训和设备。最近,该技术还被用于诊断其他疾病,如埃博拉病毒病、寨卡、中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒1,以及其他主要人畜共患疾病和动物疾病。人畜共患疾病是也会感染人类的动物疾病。 

保持互动

通讯