You are here

Как выявляют вирус COVID-19 с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени?

Nicole Jawerth

В связи с распространением по всему миру коронавируса, вызывающего инфекцию COVID‑19, МАГАТЭ в партнерстве с Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций (ФАО) предлагает странам свою поддержку и экспертные знания, чтобы помочь им использовать один из наиболее точных и быстрых лабораторных методов для обнаружения, отслеживания и изучения COVID-19 — полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).

Но что такое ОТ-ПЦР в реальном времени? Как работает этот метод? Чем он отличается от обычной ПЦР? И как это связано с ядерными технологиями? Ниже мы представим общий обзор этого метода, расскажем о принципах его работы и кратко поговорим о вирусах и генетике.

Что такое ОТ-ПЦР в реальном времени?

ОТ-ПЦР в реальном времени — это основанный на ядерных технологиях метод, который позволяет выявить присутствие определенного генетического материала любого патогена, в том числе вируса. Первоначально для обнаружения искомого генетического материала использовались радиоактивные изотопные маркеры, но в результате последующего усовершенствования этого метода изотопные метки были заменены специальными маркерами, чаще всего флуоресцентными красителями. С помощью этого метода ученые могут увидеть результаты практически сразу, еще в процессе исследования, в то время как в случае обычной ОТ-ПЦР результаты доступны только по завершении исследования.

ОТ-ПЦР в реальном времени является одним из наиболее широко используемых лабораторных методов для выявления вируса COVID-19. При том что большое число стран используют ОТ‑ПЦР в реальном времени для диагностики других инфекций, таких как болезни, вызванные вирусами Эбола и Зика, многим из них необходима помощь в адаптации этого метода к вирусу COVID‑19 и в расширении национальных возможностей в области тестирования.

Что такое вирус? Что такое генетический материал?

Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), либо рибонуклеиновой кислотой (РНК).

ДНК — это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.

РНК обычно представляет собой состоящую из одной цепи молекулу, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы те могли синтезировать и выполнять функции, обеспечивающие поддержание жизни и развитие организма. За копирование, транскрибирование и передачу отвечают различные типы РНК.

Некоторые вирусы, такие как коронавирус SARS-CoV-2, вызывающий заболевание COVID‑19, содержат только РНК, что означает, что для размножения и выживания они должны проникать в здоровые клетки. Оказавшись внутри клетки, вирус использует свой собственный генетический код (РНК в случае вируса COVID-19), чтобы взять под контроль и «перепрограммировать» клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов.

Для того чтобы при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени выявить на раннем этапе присутствие в организме такого вируса, как COVID-19, ученым необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией». Это делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью исследования методом ОТ‑ПЦР в реальном времени, применяемого для выявления вирусов.

Ученые амплифицируют определенную часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз. Амплификация важна, поскольку вместо того, чтобы пытаться найти ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации, ученые имеют достаточно большое количество заданных участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить присутствие вируса.

Как работает ОТ-ПЦР в реальном времени применительно к COVID-19?

Из тех частей тела, где скапливается вирус COVID-19, например из носа или горла человека, берется образец для проведения исследования. Образец обрабатывают несколькими химическими растворами, которые удаляют такие вещества, как белки и жиры, и извлекают только присутствующую в нем РНК. Эта извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК вируса, если она присутствует в образце.

C помощью определенного фермента производится обратная транскрипция РНК для синтеза ДНК. Затем ученые добавляют дополнительные короткие фрагменты ДНК, которые комплементарны определенным частям транскрибированной вирусной ДНК. Если в образце присутствует вирус, эти фрагменты прикрепляются к заданным участкам вирусной ДНК. Некоторые из добавленных генетических фрагментов предназначены для построения цепей ДНК во время амплификации, в то время как другие предназначены для построения ДНК и добавления к этим цепям маркерных меток, которые затем используются для выявления вируса.

После этого смесь помещается в прибор для проведения ОТ-ПЦР. Прибор выполняет циклы изменения температуры, во время которых смесь нагревается и охлаждается для того, чтобы запустить определенные химические реакции, которые создают новые точные копии заданных участков вирусной ДНК. Цикл многократно повторяется, чтобы продолжить копирование заданных участков вирусной ДНК. После каждого цикла происходит удвоение количества по сравнению с предыдущим: две копии превращаются в четыре, четыре — в восемь и так далее. Обычно при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени выполняется 35 циклов; это означает, что к концу процесса из каждой цепи вируса, присутствующей в образце, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.

По мере того как создаются новые копии вирусных участков ДНК, маркерные метки прикрепляются к цепям ДНК, а затем высвобождают флуоресцентный краситель, уровень которого измеряется вычислительным устройством прибора с выводом показателя в режиме реального времени на экран. Вычислительное устройство отслеживает уровень флуоресцентного сигнала в образце после каждого цикла. Превышение определенного уровня флуоресценции служит подтверждением присутствия вируса. Ученые также смотрят, сколько циклов требуется для достижения этого уровня для того, чтобы оценить тяжесть инфекции: чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.

Зачем использовать ОТ-ПЦР в реальном времени?

Метод ОТ-ПЦР в реальном времени имеет высокую чувствительность и точность, с его помощью можно поставить надежный диагноз всего за три часа, хотя лабораториям требуется для этого в среднем от шести до восьми часов. По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. Это по-прежнему самый точный из всех имеющихся методов для выявления вируса COVID-19.

Тем не менее, ввиду того, что вирусы присутствуют в организме только в течение определенного временного отрезка, ОТ-ПЦР в реальном времени нельзя использовать для выявления имевших место в прошлом случаев инфицирования, что важно для понимания развития и распространения вирусов. Для выявления, отслеживания и изучения перенесенных в прошлом инфекций, особенно тех, которые могли развиваться и распространяться без симптомов, необходимо использовать другие методы.

Что такое ПЦР и чем этот метод отличается от ОТ-ПЦР в реальном времени?

ОТ-ПЦР — это разновидность ПЦР, то есть полимеразной цепной реакции. Оба метода основаны на одинаковом процессе исследования, за тем исключением, что в случае ОТ-ПЦР присутствует дополнительный этап в виде обратной транскрипции (ОТ) РНК в ДНК, что необходимо для проведения амплификации. Это означает, что ПЦР используется в случае патогенов, например вирусов и бактерий, уже содержащих в себя ДНК, которую можно амплифицировать, в то время как ОТ-ПЦР используется в тех случаях, когда патоген имеет только РНК, которую необходимо транскрибировать в ДНК для амплификации. Оба метода исследования могут выполняться «в режиме реального времени», то есть их результаты будут видны практически сразу же, но при использовании их «в обычном режиме» результаты могут быть зафиксированы только по завершении реакции.

ПЦР является одним из наиболее широко применяемых диагностических тестов для выявления патогенов, в том числе вирусов, вызывающих такие болезни, как Эбола, африканская чума свиней и ящур. Поскольку вирус COVID-19 содержит только РНК, для его обнаружения используется ОТ‑ПЦР в обычном режиме или в режиме реального времени.

Уже более 20 лет МАГАТЭ в партнерстве с ФАО обучает специалистов во всем мире использованию метода ОТ-ПЦР в реальном времени и предоставляет им соответствующее оборудование, в частности, через свою Сеть лабораторий ветеринарной диагностики VETLAB. В последнее время этот метод также применяется для диагностики других заболеваний, таких как болезни, вызванные вирусами Эбола и Зика, ближневосточный респираторный синдром (БВРС), тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), а также основных болезней животных. Кроме того, он используется для обнаружения возбудителей основных зоонозных заболеваний — то есть болезней животных, которые могут также передаваться человеку.

 

June, 2020
Vol. 61-2

Мы на связи

Рассылка новостей